2.3 重组菌全细胞转化制备GABA的谷氨杆菌工艺优化2.3.1 温度对重组菌全细胞转化生产CABA的影响酶法制备GABA是一个不可逆反应，适宜的酸脱羧酶温度可以使GABA转化率达到最大，所以通过设置不同的枯草酶转化温度来探究温度对GABA转化率的影响。以100g/L的芽孢用谷氨酸为底物，溶于去离子水中，表达加入湿菌体(在55℃水浴锅预处理50min，谷氨杆菌改善细胞膜的酸脱羧酶通透性)30U/g，在150r/min的枯草水浴摇床中进行转化，反应过程中，芽孢用控制pH为5.0。表达温度梯度设置为25、谷氨杆菌30、酸脱羧酶35、枯草40、芽孢用45、表达50℃，反应24h后终止反应并进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测，结果见图9。转化率随温度升高逐渐提高.当转化温度达到40℃时，GAD-0和GAD-PL转化率达到最高，分别为64.78％和82.27％，继续升高温度，转化率反而降低。这是因为枯草芽孢杆菌细胞壁厚，而反应温度过低时，底物与胞内酶液无法充分接触使得转化率低：当反应温度过高时，酶与PLP稳定性差，从而影响GABA的转化率。
2.3.2 DH对重组菌全细胞转化生产GABA的影响以100g/L的谷氨酸为底物.溶于去离子水中，加入预处理过的湿菌体30U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床巾进行转化，反应过程中，每隔2h用0.6mol/L的H2S04或NaOH调节pH，使其始终与初始pH保持一致。pH梯度设置为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反应24h后终止反应并进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测。结果见图10，当pH为4.5或5.0时，GABA转化率最高，GAD-0的GABA转化率为75.45％和76.21％，GAD-PL的GABA转化率为84.54％和84.21％。当DH小于4.5时，底物-水谷氨酸钠在酸性条件下容易酸水解生成谷氨酸析出，从而形成乳白色浑浊液体.不利于酶与底物的充分结合；当pH大于5.0时不利于酶活性巾心的赖氨酸残基以shifft-碱与PLP、底物结合，从而抑制GABA的生成。可见，酶转化法制备GABA的pH耐受范围窄，过酸或过碱都不利于酶促反应进行，考虑在高质量浓度底物下，过低的pH更容易导致底物析出，所以酶转化最适pH为5.0。
2.3.3 加菌量对重组菌全细胞转化生产GABA的影响以100g/L的谷氨酸为底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体(20、30、40、50、60U/g)，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应24h，反应过程中，控制pH为5.0。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释后用氨基酸柱前衍生法进行HPLC检测。结果见图11，重组菌全细胞转化率随着加菌量的增加而逐渐提高，其中GAD-PL和GAD-0分别在40U/g和50U/g时将底物完全转化，转化率达到100％。GAD-PL的加菌量少于GAD-0是因为前者细胞巾的PLP含量高于后者，PLP作为辅助因子有利于酶促反应的进行。
2.3.4 反应时间对重组茵全细胞转化生严GABA的影响以100g/L的谷氨酸为底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体，GAD-0和GAD-PL加入量分别为50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应24h，反应过程中，控制DH为5.0。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测，结果见图12。在0～20h，GAD-0和GAD-PL转化合成GABA的产量随时问延长迅速增加，在20h时转化率达到100％，之后随着反应进行，转化率不再发生变化。 2.3.5 底物质量浓度对重组菌全细胞转化生严GABA的影响以200g/L的谷氨酸为初始底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体，GAD-0和GAD-PL力口菌量分另0为50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应6h后，每隔3h补加1.27g的谷氨酸同体至底物质量浓度分别为200、250、300、350、400g/L，反应过程中，控制pH为5.0，反应48h。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测。结果见图13，当底物质量浓度达到400g/L谷氨酸时，GAD-0和GAD-PL转化生产GABA的转化率分别从100％(底物质量浓度350g/L谷氨酸)下降为97.72％和98.43％。综合考虑，为提高工业生产效率和节省下游分离纯化成本，选择350g/L作为酶法制备GABA的最适底物质量浓度。
3 结语作者成功构建并重组表达了含有Escherichiacoli来源的gadB基因的重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。实验表明在发酵过程中添加0.5mmol/L辅酶前体PL的GAD总酶活达到28.14U/mL，是对照总酶活的1.72倍。进一步优化重组菌全细胞酶法生产GABA的工艺条件，结果表明，当温度为40℃，pH为5.0，GAD-0和GAD-PL的最适加菌量分别为50U/g和40U/g时，GABA转化率达到100％。当谷氨酸质量浓度为400g/L时，GABA产量分别为275.60扎和273.61g/L。综上所述，作者考察了菌体发酵培养过程中添加辅酶前体PL对重组菌产GAD及制备GABA的影响，开发了一种不需要在发酵过程和酶转化体系巾添加昂贵辅酶PLP就能高效生产GABA的T艺技术，为GABA在食品和医药行业中的广泛应用打下了坚实基础。 声明：本文所用图片、文字来源《食品与生物技术》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系 相关链接：谷氨酸，氨基酸，谷氨酸钠，枯草芽孢杆菌 |
“放心消费在南京”社区行活动启动镁单元素溶液标准物质：助力镁元素定量分析ETTOI高奢运动新系列 拥抱活力春日乙二胺四乙酸（EDTA）二钠溶液标准物质：金属离子螯合校准的金标准镍元素溶液标准物质：提升检测精度与可靠性山东济南：开展“秤心良品”计量专项整治行动男生女生HEYLADS童装 定义青少年个性潮流自如携手景顺成立资管平台“星耀如景”， 首发12亿保租房项目将落地北京美赞臣婴幼奶粉（品牌介绍及产品推荐）Jnby by JNBY 25SS牛仔系列 塑造成长新风尚钒元素溶液标准物质：助力科研与工业分析奋进新征程 建功新时代▪伟大变革|靠前服务 蹚出网络食品监管新路径农村环境监测的布点原则与指标优化3•15在行动｜考证在线培训，套路咋就那么多（下）承诺天花乱坠 交费容易退费难黄芪中黄酮类成分的研究进展 （一）高效液相色谱法测定鲜虾中4响应面法优化低糖保健枣酱的制作工艺研究（一）中国消费者协会等单位联合倡议：反对商品过度包装 践行简约适度理念jnby by JNBY上新 随性生长 自有腔调Windows 7带动商机 玻璃基板产能满载,行业资讯复配食品添加剂对莜麦蔓越莓面包品质的影响（一）快递面单竟成了广告阵地
安徽省消保委调查发现七成以上来自“三通一达”铁皮石斛多糖提取及抗氧化活性研究（一）六个月宝宝喝奶奶瓶和鸭嘴杯哪种更适合？超声辅助蒸馏法提取野菊花挥发油的工艺研究不同洁净度葡萄的葡萄酒发酵效果研究（二）最高收费每人8元 经营者收取“餐位费”涉嫌侵害消费者知情权北美玻璃协会加入零能源商业建筑联合会,行业资讯安聪慧：吉利控股集团智驾一盘棋 千里科技、浩瀚智驾已全面整合玻璃产业改变公开 产业创新仍任重道远,市场研究麦冬的炮制研究进展（一）奶粉中营养元素检测方法的研究进展（一）石花菜化学成分与药理作用研究进展（三）城堡剧院正在进行一个600万美元的玻璃更换项目,行业资讯备孕小白必看！碱水煮粥调理饮食，提高受孕率，让宝宝更健康！收到的奶粉盲盒货不对板 海普诺凯被质疑虚假宣传食品添加剂二氧化碳中氰化氢测定方法的问题探索小玻跑展会—北京玻璃展倒计时2天,图片新闻正在备孕发烧了37.5转谷氨酰胺酶催化的糖基化修饰对黑豆蛋白抗氧化活性的影响（二）
